急性皮肤毒性试验可以确定受试物是否经过皮肤吸收和短期作用产生的毒理毒情反应，可以为化妆品原料毒性分级和标签标识以及确定亚慢性毒性试验和其他的毒理学试验剂提供依据，急性经皮毒性试验是毒理检测中的一种试验检测项目。下面为大家介绍GB／T 15670.5-2017《农药登记毒理学试验方法 第5部分：急性经皮毒性试验》标准方法。

　　急性经皮毒性试验标准方法GB／T 15670.5-2017介绍 

　　范围

　　GB/T 15670的本部分规定了急性经皮毒性试验的基本原则、方法和要求。本部分适用于为农药登记而进行的急性经皮毒性试验。

　　规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必备的。只要注日期的引用文件,仅注日期的版本就适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

　　GB 14925 实验动物 环境及设施

　　农药登记资料规定(中华人民共和国农业部令[2007]第10号)

　　术语和定义

　　1、急性经皮毒性（acute dermal toxicity）

　　经皮肤染毒受试物连续接触24小时所产生的健康损害效应。

　　2、剂量（dose）

　　所给受试物的量,以实验动物单位体重所接受受试物的质量表示(mg/kg 体重)。

　　3、半数致死剂量（median lethal dose）

　　一次或在24小时内多次给予实验动物受试物后,引起实验动物总体中半数死亡的毒物统计学剂量。用实验动物单位体重接受受试物的质量表示(mg/kg体重)。

　　4、剂量-反应关系（dose-response relationship）

　　剂量与特定效应的发生率间的关系。

　　试验目的

　　通过24小时内连续经完整皮肤染毒受试物,观察受试物对实验动物所产生的毒性作用,初步了解受试物能否经皮肤吸收和毒作用模式,为急性毒性分级、标签管理及其他毒理学试验剂量的选择提供依据。

　　试验概述

　　实验动物受试部位的被毛要在试验前去除，把实验动物分成若干剂量组(至少3个组),每组涂布不同剂量的受试物﹐然后观察实验动物中毒反应和死亡情况,对试验中死亡和试验结束时处死的动物应做大体解剖,计算LD和95%可信区间。

　　试验方法

　　1、受试物配制

　　液态受试物一般使用原液。固体受试物应将其研磨成粉状过100目筛,并用水或其他无毒、无刺激性、不影响皮肤通透性,也不与受试物反应的介质充分湿润，来确保受试物和皮肤达到良好的接触。

　　2、实验动物

　　2.1、种属和体重

　　首选大鼠,也可选白色家兔、白色豚鼠或非啮齿类动物。选用大鼠以外的臭他实验动物应说明理由。实验动物体重要求范围分别为:大鼠200 g 300 g.白色家兔2.0 kg~3,0 kg豚鼠350 g~450 g。可选国内常用品系。雌性动物应为未妊娠和未经产的。

　　2.2、动物性别

　　选择最敏感的性别动物进行试验。不能确定时,可提供两种性别动物的试验结果;或先进行一种性别动物的试验后,再至少选择另外一种性别的5只动物在相同剂量下染毒,评估最敏感性别的动物。如果有足够的证据表明所试验的动物性别肯定是最敏感的,可不必再进行第二种性别的染毒试验。

　　2.3、饲养环境

　　正式试验前，动物应在试验环境中检疫、适应3d~5d时间。

　　实验动物饲养环境条件应符合GB 14925的有关规定。试验期间,为避免实验动物相互抓挠、舔食,推荐采用单卷饲养。

　　3、剂量和分组

　　3.1、剂量

　　通过每剂量一只动物的预试验确定剂量范围。剂量设计可采用霍恩氏法,概率单位法等。至少应设3个剂量组,组间距应根据受试物毒作用特征决定,但应能保证动物出现一定梯度的毒性作用和死亡率,以满足计算半数致死剂量的需要。

　　3.2、限量试验

　　一般情况下﹐使用啮齿类动物时,一次染毒两种性别各5只动物,2 000 mg/kg体重,或根据管理上的需要也可选择5 000 mg/kg 体重剂量进行试验。特殊情况下,限量试验可采用更高的剂量。如果没有死亡发生,可结束试验,不需要做多组试验。如果出现与染毒有关的死亡,需要进行多个剂量的试验。

　　3.3、动物分组

　　实验动物随机分组,大鼠或豚鼠每一剂量组(单性别)大于等于5只;家兔每一剂量组(单性别)大于等于4 只。

　　4、试验步骤

　　4.1、备皮

　　试验前24小时,在动物背部正中线两侧去毛,仔细检查皮肤,要求完好无损,防止改变皮肤的通透性。染毒面积不应少于实验动物体表面积的10%。应通过对动物体重的测定确定染毒部位的面积。

　　4.2、动物的固定

　　染毒时应采用必要的措施对动物进行适当固定,并需要一定程度的松动,不推荐完全限制动物活动的方法。

　　4.3、染毒操作

　　将受试物均匀涂布于实验动物的去毛区,面积略小于去毛区,记录染毒面积。覆盖一层不渗透材料后再以2层～8层的多孔够布覆盖,并用无刺激性胶布或者绷带加以固定,保证到受试物与皮肤密切接触，防止受试物挥发、脱落和被动物舔食。接触24 h后取下固定物和覆盖物,用毫水或适当的方法清除皮肤上残留的曼试物。在保证受试物与皮肤充分接触的条件下,对毒性较大的受试物,可根据剂量相对减小染毒区域的面积。

　　5、试验观察和检查

　　5.1、观寰期限

　　每天观察一次，连续14d记录史毒发生)发展过程，死选情况.观察期限也不是团定的，根据毒性反应，反应出现和消失的时间可做出调鉴.如果动物中毒反应、死豢时间延迟(染毒后4 d后才显示)，观察期限应适当延长，最长不超过21d。

　　5.2、观察内容

　　5.2.1临床观察

　　观察至少包括皮肤.被毛、眼﹑黏膜的改变和呼吸系统,神经系统﹑肢体活动.行为方式等变化发生的时间﹑程度和持续时间观察的内容包括：

　　a)中枢神经系统和神经肌肉系统.体位异常、叫声异常、不安采滞,震颤、抽搐、麻痹、运动失调、对外反应过敏或迟钝,是常行为如过度反复抓挠口周、梳理搂圈,甚至自残﹑倒退行走等;

　　b)植物神经系统:瞳孔扩大或缩小流涎或流泪；

　　c)呼吸系统:鼻孔流液﹑鼻棚、鼻翼扇动,呼吸深缓、呼吸过速、蜂腰：d)泌尿生殖系统:会阴部污秽、有分泌物、阴道肿胀;

　　d)泌尿生殖系统:会阴部污秽、有分泌物、阴道肿胀;

　　e)皮肤和被毛:皮肤充血、紫绀.被毛蓬松或潮湿、污秽;

　　f)眼:眼球突出﹑结膜充血﹑溢血性分泌物﹑角膜混浊；

　　g)消化系统:腹泻、厌食。

　　应特别注意染毒区皮肤的反应。如发现动物死亡或处于体弱、濒死状态,应及时与其他动物分离，并记录发生的时间,称量体重,解剖检查,以减少动物同类互残及死后组织自溶,避免动物信息的丢失。如果死亡动物不能立即进行大体解剖检查,应保存在能够减少自溶的低温环境中(冷藏,不能冷冻),并在24h内进行解剖检查。

　　5.2.2、体重称量

　　应分别在染毒前、染毒后(至少每周一次)和处死前称量并记录动物体重。

　　5.3、病理学检查

　　在试验期内中毒死亡的和人道处死的动物应做大体解剖,记录每只动物的大体病理改变。染毒后存活时间大于等于24 h的动物其器官显示有大体病理改变﹐则需进行组织病理学检查,以便获取有关毒作用的信息。必要时对染毒区和临近非染毒区皮肤作组织学检查。

　　试验结果和评价

　　1、结果处理

　　1.1、妳用表格列出试验中获得的各组(两种性别或单性别)动物的全部原始数据,内容应包括:动物编号,性别、染毒剂量、体重,各种体征的有无及程度、死亡或存活状况,大体解剖及组织病理学检查时各病变的有无及程度。

　　1.2、分别统计各组及不同性别动物的数量,体征发生、死亡、存活及大体解剖和组织病理学检查的各类病变发生的频数﹐计算不同组、不同性别动物上述各项的发生率及不同时间的体重均值。

　　1.3、用适宜的统计学方法对上述数据进行统计学分析。

　　1.4、用适宜方法计算LDs值和95%可信区间。

　　2、结果评价

　　2.1、对受试物能否经皮吸收及毒作用特点做出初步评价。

　　2.2、受试物的毒作用水平,如能得到剂量-反应关系曲线，可对急性经皮毒作用阈值做出初步评价。

　　2.3、明确是以何种性别的动物和接触时间得到的毒性参数。

　　2.4、急性经皮毒性级别按照《农药登记资料规定》中 3.3.2.8的相应标准判定。

　　试验报告

　　试验报告至少应包括以下内容：

　　a)试验名称、试验单位名称与联系方式，报告编号；

　　b)试验委托单位名称和联系方式,样品受理日期和封样情况；

　　c)试验开始和结束日期、试验项目负责人、试验单位技术负责人,签发日期;d)试验摘要；

　　e)受试物名称、有效成分美国化学文摘登录号(CAS号)(如已知),代码(如有)、纯度(或含量)、剂型、生产日期(批号)、理化性质、配制所用溶剂和方法；

　　f)实验动物种属、品系、级别﹑数量、体重、性别、来源(供应商名称﹑实验动物质量合格证号、实验动物生产许可证号) ,检疫、适应情况,实验动物饲养环境,包括温度﹑相对湿度﹑饲料,单笼饲养或群饲、实验动物设施使用许可证号；

　　g)剂量和组别,包括选择剂量的原则或依据、剂量和组别,动物分组方式和每组每种性别动物数；

　　h)试验条件和方法,包括主要仪器设备,染毒途径,染毒方案、试验周期﹑观察指标等;

　　i)试验结果：以文字描述和表格逐项进行汇总,包括临床中毒表现,中毒表现出现、持续和恢复时间,染毒后出现死亡的时间,体重变化,与剂量的相关性以及大体解剖和组织病理学改变等,指出结果的统计处理方法；

　　j)试验结论;给出明确结论,如LD。,95%可信区间和毒性分级,必要时对有关问题进行讨论；

　　k)原始记录保存情况的说明。

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